病毒檢測之細胞治療原材料
Carl Zimmer在《病毒星球》一書中寫道，早在40億年前，地球就已經是一顆“病毒星球”。如今，生物呈現出的多樣性很大一部分得益于病毒，就連我們賴以生存的氧氣也有1/10是在病毒幫助下產生的，地球溫度也與病毒活動息息相關。
病毒如此之多，哪些與細胞原材料相關？除了傳染四項HBV、HCV、HIV、TP之外，FDA對免疫細胞捐獻者規定又是什么？先了解一下HBV、HCV、HIV、TP、HTLV、CMV、WNV、EBV、B19傳播途徑、傳染特點。
1、乙型肝炎病毒（HBV）
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）是引起乙型肝炎（簡稱乙肝）的病原體，屬嗜肝DNA病毒科，該科病毒包含正嗜肝DNA病毒屬和禽嗜肝DNA病毒屬兩個屬，引起人體感染的是正嗜肝DNA病毒屬。HBV病毒通過母嬰垂直傳播、血液（包括皮膚和黏膜微小創傷）和性接觸傳播。
HBV如何引起乙型肝炎的呢？如圖，HBV病毒顆粒結合肝細胞膜上NTCP（鈉離子-?；悄懰?協同轉運蛋白），開啟了病毒在肝細胞內復制的里程。目前乙肝新藥的研究主要是圍繞靶向HBV病毒并干擾HBV的復制過程，如進入抑制劑Myrcludex B、SiRNAs、HBsAg抑制劑等。
一般根據乙肝病毒感染病程是否超過6個月來區分急性和慢性乙型肝炎。急性乙型肝炎，病程多在6個月內，且90％～95％可自發性清除HBsAg而臨床痊愈，僅少數病人可轉為慢性。慢性乙型肝炎是指急性乙肝病程超過半年者, 或發病日期不明確或無明確肝炎病史，HBsAg和（或）HBV DNA陽性6個月以上。
乙肝兩對半是國內醫院最常用的乙肝病毒（HBV）感染檢測血清標志物。乙型肝炎病毒免疫學標記一共3對，即表面抗原（HBsAg）和表面抗體（抗HBs或HBsAb）、e抗原（HBeAg）和 e抗體（抗HBe或HBeAb）、核心抗原（HBcAg）和核心抗體（抗HBc或HBcAb）。乙肝兩對半又稱乙肝五項，其檢查意義在于：檢查是否感染乙肝及感染的具體情況。
2、丙型肝炎病毒（HCV）
丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）屬于黃病毒科肝炎病毒屬，其基因組為單股正鏈RNA，由約9.6×103核苷酸組成。HCV基因組含有一個開放讀框（ORF），編碼10余種結構和非結構（NS） 蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。NS3/4A、NS5A和NS5B是目前DAAs的主要靶位。
DAA小分子藥物是指直接抗病毒（direct-acting antiviral agents，DAA）小分子藥物。DAA通過抑制HCV生命周期中的這些重要病毒蛋白，從不同階段阻斷HCV肝內復制進而發揮抗病毒療效，如蛋白酶抑制劑（PI）、N核苷聚合酶抑制劑（NPI）、非核苷聚合酶抑制劑（NNPIs）。
HCV主要經血液、體液傳播，丙型肝炎病毒抗體（HCV-Ab）是由于人體免疫細胞對HCV感染所做出的反應而產生的。抗-HCV檢測（化學發光免疫分析法或酶免疫法）可用于HCV感染者的篩查。下圖是檢測HCV感染的步驟。
3、人類免疫缺陷病毒（HIV）
人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus, HIV）是引起獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）的病毒。它以人體免疫系統中最重要的CD4 T淋巴細胞作為攻擊目標，大量吞噬、破壞CD4 T淋巴細胞，從而破壞人的免疫系統，最終使免疫系統崩潰，使人體因喪失對各種疾病的抵抗能力而發病并死亡。
艾滋病病毒亞型主要有兩種型號：HIV-1型和HIV-2型。大兩種亞型的發病和感染原理都差不多。1型是目前最普遍的一個亞型，幾乎全球95%的HIV感染都是1型。對比HIV-2來說，HIV-1有更短的潛伏期，更高的發病率，以及更高的傳染率。
HIV包膜gp120糖蛋白與T細胞表面受體CD4結合，然后與共受體CCR5或CXCR4結合，從而使病毒與細胞表面融合，拉開了病毒入侵的序幕。依據此機制，2006年美國HIV患者Timothy Ray Brown確診為急性骨髓性白血病，接受CCR5基因突變捐獻者的骨髓移植后白血病和HIV同時治愈，震驚了世界，被稱為“柏林病人”。這一治療方案也已被成功復制，一位患有霍奇金淋巴瘤和HIV-1感染的倫敦男子，同樣接受了CCR5突變的造血干細胞移植獲得治愈。
HIV檢測主要包括抗HIV病毒抗體檢測、病毒培養、核酸檢測和抗原檢測。其中對HIV病毒抗體的檢測是最常規使用的方法，這不但是由于這類檢測特異性、敏感性較高，方法相對簡便、成熟，更重要的原因是HIV抗體在病毒感染后除早期短暫的”窗口期”外的整個生命期間長期穩定地存在并可被檢測到。
4、梅毒螺旋體（TP）
梅毒螺旋體亦稱蒼白螺旋體(Treponemiapallidum, TP),在分類學上屬螺旋體體目密螺旋體科密螺旋體屬。梅毒螺旋體（Treponema Pallidum）是梅毒感染的病原體。
圖為梅毒患者的血清學反應
梅毒的診斷試驗包括梅毒血清學檢測（STS），含篩選（反應素或者非梅毒螺旋體）、試驗驗證性（梅毒螺旋體）、顯微鏡檢查。梅毒血清試驗（VDRL）及快速血漿反應素（RPR）試驗是用于篩查梅毒的敏感、簡便、低廉的試驗。密螺旋體試驗定性特異性的檢測密螺旋體抗體，包括：FTA-Abs、MHA-TP、TPHA 等。
5、巨噬病毒（CMV）
巨噬細胞病毒（Cytomegalovirus, CMV）屬于皰疹病毒科，其結構與其他皰疹病毒相似，內有雙股DNA，由核衣殼蛋白包裹，外層為含有糖蛋白的脂雙層膜。感染人類的品種稱 human CMV (HCMV) 或Human herpesvirus-5 (HHV-5)。
CMV主要在成纖維細胞、上皮細胞和內皮細胞內復制，幾乎存在于人體各種器官和組織，并可經尿液、唾液、血液、乳汁等排出。HCMV感染細胞機制比較復雜，如下圖感染纖維細胞和上皮細胞通過gB和gH/gL/gO組成的糖蛋白復合物，而上皮細胞感染還依賴gH、gL、UL128、UL130和UL131A組成的包膜五聚體復合物。
CMV感染者和潛伏感染者是傳播源，主要通過密切接觸、消化道傳播和母胎垂直傳播。感染后的機體存在2-3周窗口期，然后產生非中和抗體IgM和IgG。HCMV是最常見的引起胎兒宮內感染病原體之一，會出現嬰兒CMV肝炎、聽力損失、智力障礙等嚴重后遺癥，因此會根據孕期CMV IgM和IgG抗體檢測結果判斷母體感染類型。
6、人嗜T淋巴細胞病毒（HTLV）
1980年分離出第一個人類逆轉錄病毒（human T-cell lymphotropic virus 1，HTLV-1），標志著人類逆轉錄病毒時代的開始。人類嗜T淋巴細胞病毒（HTLV）是一種單正鏈RNA病毒，屬于逆轉錄病毒科，RNA腫瘤病毒亞科。目前已發現HTLV有四型為HTLV-1/-2/-3/-4，其中HTLV-1、HTLV-2分布與流行范圍最廣。
95%的感染者沒有臨床癥狀，只有5%的感染者會出現臨床癥狀。HTLV-I感染有可能導致成人T細胞白血病/淋巴瘤（ATLL），HTLV-I相關性脊髓病/熱帶痙攣性癱瘓癥（HAM/TSP）以及HTLV-葡萄膜炎。HTLV-II的感染者有極低的可能性導致非典型性毛細胞白血病以及更為少見的痙攣性脊髓病。
HTLV-1和HTLV-2的主要傳播方式為母嬰傳播、性傳播和血液傳播。以細胞-細胞的形式進行傳播，游離的病毒顆粒幾乎不能感染細胞，感染者血漿中也幾乎不存在游離的病毒顆粒。研究發現HTLV-1病毒能夠用病毒的蛋白質和遺傳物質在細胞表面重建細胞骨架，通過細胞與細胞之間的聯系感染新的細胞。病毒感染的T細胞與未感染的T細胞接觸40min后，病毒蛋白Gap和Env會分布在細胞相互接觸的一端，120min后Gap蛋白轉移到未感染的T細胞。
HTLV病毒在我國的流行率很低,在加勒比海地區、南美東北部、日本西南部以及非洲的某些地區呈地方性流行。HTLV已經在世界范圍內逐漸成為常規的檢測項目，主要用于獻血者篩查，器官移植和臨床診斷應用。篩查方法基于檢測HTLV-1和/或-2的抗體。自2015版《血站技術操作規程》發布后，HTLV成為了繼HBV、HCV、HIV、TP后一種新的病毒篩查項目。
7、 EB病毒（EBV）
EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）屬于皰疹病毒屬γ亞科。通過唾液傳播，最初感染口咽和鼻咽上皮細胞，隨后進入深層組織，感染B淋巴細胞，也可以感染NK細胞、T淋巴細胞和平滑肌細胞。
B細胞感染始于EBV表面的包膜蛋白gp350/220與B細胞表面的CD21分子結合，再由EBV糖蛋白gp42與B細胞表面HLA-Ⅱ類分子相互作用，隨后經核融合復合體 (gH/gL/gp42)誘導病毒包膜與B細胞內吞膜融合，使病毒粒子釋放入B細胞。缺乏CD21時，由gp85、gp25、gp42三種糖蛋白組成的gH/gL復合體可作為配體與細胞整合素αvβ5/6/8結合，從而誘發病毒包膜與上皮細胞的融合以幫助EBV感染上皮細胞及其鄰近細胞。
EBV編碼多種結構抗原，包括病毒衣殼抗原(viral capsid antigen，VCA)、早期抗原(early antigen，EA)、膜抗原(membrane antigen，MA)、核抗原(nuclear antigen，NA)等。機體感染EBV后針對不同的抗原產生相應的抗體。
血清特異性抗體檢測通常用來判斷EBV感染狀態。對于免疫功能正常的患者，一般情況下VCA－IgM、VCA－IgG、EBNA－IgG 3個抗體的檢測結果可以區分EBV原發感染和既往感染。
8、人細小病毒B19
人細小病毒B19(Human parvovirus B19)是兒科常見的出疹性疾病(又稱第五病)的病因。B19隸屬于細小病毒科嗜紅細胞病毒屬，可通過呼吸道粘膜和輸血傳播，通常無癥狀感染，但也會造成幼兒的傳染性紅斑、成年人的關節炎、孕婦的胎兒水腫和死亡等疾病。
B19利用紅細胞糖苷脂Gb4Cer、α5β1-整聯蛋白、Ku80等細胞受體進入宿主細胞。Gb4Cer存在于紅系細胞、血小板、粒細胞表面，也存在于心臟、肺部、肝臟、腎臟、滑膜、內皮細胞以及消化道粘膜。所以這些細胞、組織都有可能成為B19感染的標靶。
診斷成人B19近期感染最敏感的試驗是IgM抗體檢測。大約90%的病人在癥狀出現后3天即可通過酶免疫試驗檢測到B19的IgM抗體，抗體的陽性率和滴度在發病后30～60天后開始下降。B19 IgG抗體通常在發病后7天出現，持續數年。
9、西尼羅病毒（WNV）
西尼羅病毒（West Nile Virus）相對陌生，其實擁有著我們很熟悉的“家庭成員”——乙型腦炎病毒、丙型肝炎病毒、登革熱病毒、寨卡病毒，等等。1937年12月，西尼羅病毒從烏干達西尼羅省1名發燒女子的血液標本中首次被分離出來，因此被命名為“西尼羅病毒”。自1999年8月WNV在紐約市被發現，現已遍布美國各地，WNV現在在北美被認為是地方病。
WNV主要通過蚊蟲叮咬感染，但80%的感染者是隱性感染，只有20%的感染者會出現發熱、頭痛、肌痛、惡心、嘔吐等癥狀。一些患者有淋巴結腫大和胸、腹、背部的皮疹，這被稱為“西尼羅熱”。另有1%的感染者會被病毒侵入中樞神經系統，發生“西尼羅腦炎”，其為WNV主要致死的原因，病死率約為3%至5%。
臨床上如果懷疑西尼羅病毒感染，采用IgM抗體捕捉酶聯免疫吸附試驗(MAC-ELISA)檢測血清中有無西尼羅病毒IgM抗體。有神經系統癥狀的患者應進行腰椎穿刺，除了檢測血清外，還應檢測腦脊液中有無IgM抗體。
免疫細胞樣本的病毒檢測要求
細胞、組織、細胞及組織制品的捐獻者的病毒檢測FDA有明確的規定Testing Donors of Human Cells, Tissues, and Cellular and Tissue-Based Products (HCT/P): Specific Requirements，其中免疫細胞涉及的病毒需檢測HIV、HBV、HCV、TP、HTLV、CMV、 WNV。
隨著細胞/基因治療領域的高速發展，高質量、健康的細胞原材料變得越來越重要，一個多樣化且穩定的供體庫有助于獲得高質穩定的細胞原料。除了SARS-CoV-2病毒之外，我們的樣本庫依據FDA的要求以及病毒地域性差異，對HIV、HBV、HCV、TP、HTLV、HCMV、 EBV、B19病毒進行檢測。其中HCMV同時檢測IgG、IgM，IgM必為陰性確保近期無感染。WNV只曾在我國新疆區域出現過，可進行定制化檢測。
